據(jù)WHO 2月10日數(shù)據(jù)顯示，目前全球有超過(guò)4萬(wàn)例確診病例，已經(jīng)造成了至少900人死亡，這種冠狀病毒被認(rèn)為是一種新型冠狀病毒（2019-nCoV），其與多種蝙蝠冠狀病毒及SARS冠狀病毒具有高度相似性；相比SARS冠狀病毒而言，新型冠狀病毒似乎更容易人傳人，其能在幾個(gè)大洲快速傳播，并讓W(xué)HO宣布全球進(jìn)入公共衛(wèi)生應(yīng)急狀態(tài)。新型冠狀病毒能利用一種緊密糖基化的、同源三聚體I類(lèi)融合凸起蛋白（S蛋白）來(lái)進(jìn)入宿主細(xì)胞中，S蛋白能以一種相對(duì)穩(wěn)定的融合前構(gòu)象存在，并經(jīng)歷劇烈的結(jié)構(gòu)重排來(lái)促進(jìn)病毒膜結(jié)構(gòu)與宿主細(xì)胞膜進(jìn)行融合，這一過(guò)程是由病毒S1亞單位與宿主受體的結(jié)合所誘發(fā)，其能破壞融合前三聚體的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致S1亞單位脫落，并促使S2亞單位轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨确€(wěn)定的融合后構(gòu)象。為了能與宿主受體相結(jié)合，S1的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域會(huì)經(jīng)歷鏈狀樣的構(gòu)象運(yùn)動(dòng)，這種運(yùn)動(dòng)方式會(huì)暫時(shí)隱藏或暴露受體結(jié)合的決定因素，這兩種狀態(tài)被認(rèn)為是“向上”或“向下”構(gòu)象，其中向下的構(gòu)象對(duì)應(yīng)的是受體不可及的狀態(tài)，而向上構(gòu)象則對(duì)應(yīng)著受體可達(dá)的狀態(tài)，后者被認(rèn)為具有不穩(wěn)定。由于S蛋白不可或缺的功能，因此其有望成為抗體所介導(dǎo)的中和作用的易感性靶點(diǎn)，而融合前的S結(jié)構(gòu)則能夠提供原子水平的信息來(lái)幫助指導(dǎo)科學(xué)家們進(jìn)行疫苗的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)。

基于此前研究人員所報(bào)道的新型冠狀病毒基因組序列，這項(xiàng)研究中，研究人員表達(dá)了新型冠狀病毒的胞外域1-1208的殘基，同時(shí)基于此前的穩(wěn)定化策略（對(duì)β冠狀病毒S蛋白非常有效）在S2融合機(jī)器的C末端添加了兩個(gè)穩(wěn)定的脯氨酸突變，研究者從293個(gè)細(xì)胞中獲得了約為0.5mg/L的重組融合前穩(wěn)定的S胞外域結(jié)構(gòu)，同時(shí)利用親和色譜和尺寸排阻色譜技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行了純化，隨后研究者利用純化且完全糖基化的S蛋白制備了Cryo-EM（冷凍電鏡）網(wǎng)格。

當(dāng)研究人員收集并加工處理了3207張顯微照片后，他們獲得了一個(gè)3.5埃分辨率的3D非對(duì)稱(chēng)三聚體的重建圖像，其中能在“向上”的結(jié)構(gòu)域中觀察到單一的受體結(jié)合域，由于受體結(jié)合域的尺寸較?。?-21kDa），因此在進(jìn)行三維重建和分類(lèi)之前，這種構(gòu)象的對(duì)稱(chēng)性或許并不明顯。在cryoSPARC v2算法中3D可變性特征的幫助下，研究人員就能夠在受體結(jié)合域進(jìn)行鏈狀移動(dòng)時(shí)觀察到S1亞單位的結(jié)構(gòu)，這種運(yùn)動(dòng)或許就會(huì)導(dǎo)致S1相對(duì)于更穩(wěn)定的S2而言表現(xiàn)出局部分辨率較低的狀況。這種看似隨機(jī)的受體結(jié)合域移動(dòng)也能夠在SARS冠狀病毒MERS冠狀病毒，甚至親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的豬流行性腹瀉病毒中都能觀察到，在新型冠狀病毒S蛋白中所觀察到的結(jié)果就表明，其或許擁有被認(rèn)為在冠狀病毒科保守的相同誘發(fā)機(jī)制，其中受體與暴露的受體結(jié)合域的結(jié)合會(huì)引發(fā)不穩(wěn)定構(gòu)象的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致S1亞單位脫落，S2亞蛋白重新發(fā)生折疊。

由于S2亞單位似乎是一種對(duì)稱(chēng)的三聚體，因此研究人員對(duì)其進(jìn)行了3D精細(xì)化處理使其具有C3對(duì)稱(chēng)性，這樣就生成了一個(gè)3.2埃分辨率的圖譜，其所呈現(xiàn)的S2亞單位的致密度較好，利用上述圖譜，研究人員構(gòu)建了新型冠狀病毒的大部分胞外域區(qū)域，其中包括每個(gè)三聚體上的66個(gè)連接糖基化位點(diǎn)中的44個(gè)糖基化位點(diǎn)，研究者所得到的最終模型跨越了S殘基22-1146（位點(diǎn)），其中省略了一些靈活的環(huán)路；與此前所報(bào)道的所有冠狀病毒的胞外域結(jié)構(gòu)一樣，新型冠狀病毒S蛋白的密度在連接域后也開(kāi)始下降，從而就反映出了融合前構(gòu)象中七肽重復(fù)區(qū)2結(jié)構(gòu)域（HR2，heptad repeat 2）的靈活性。

新型冠狀病毒S蛋白的整體結(jié)構(gòu)類(lèi)似于SARS冠狀病毒S蛋白的結(jié)構(gòu)，其二者在超過(guò)959個(gè)Cα原子上的均方根偏差（RMSD）為3.8埃（A），它們之間在結(jié)構(gòu)上最大的差異是其各自“向下”構(gòu)象中受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域位置之間的構(gòu)象差異，處于“向下”構(gòu)象的SARS冠狀病毒受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域能與相鄰原聚體的N末端結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合，而新型冠狀病毒的的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的角度則更接近同源三聚體的中心腔位置；盡管存在一定的構(gòu)象差異，但當(dāng)新型冠狀病毒S蛋白的單一結(jié)構(gòu)域與SARS冠狀病毒S蛋白對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)域?qū)R時(shí)，它們就能夠反映兩種蛋白之間較高程度的結(jié)構(gòu)同源性。

新型冠狀病毒與蝙蝠冠狀病毒RaTG13的S蛋白的序列同源性大約為96%，最明顯的變化源于S1/S2蛋白酶切割位點(diǎn)的插入，從而導(dǎo)致新型冠狀病毒出現(xiàn)了“RRAR”成對(duì)堿性氨基酸蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)，而不是SARS冠狀病毒中的單一精氨酸位點(diǎn)；目前研究人員已經(jīng)在流感病毒中觀察到了類(lèi)似的現(xiàn)象，即在高毒性禽流感病毒和人流感病毒中的相關(guān)位置所發(fā)現(xiàn)的能產(chǎn)生多元成對(duì)堿性氨基酸蛋白酶位點(diǎn)的氨基酸插入。除了S1/S2連接處插入的殘基外，新型冠狀病毒的S蛋白和RaTG13的S蛋白之間還存在29個(gè)可變的殘基，其中17個(gè)殘基位置能夠映射到受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中；隨后研究人員分析了來(lái)自全球共享禽流感數(shù)據(jù)倡議組織（GISAID）中61個(gè)可用的新型冠狀病毒S蛋白的序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有序列中僅存在9個(gè)氨基酸的替換，大部分替換都是保守性的，而且研究者預(yù)測(cè)，其也不會(huì)對(duì)新型冠狀病毒的S蛋白的功能或結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響。

有研究表明，新型冠狀病毒的S蛋白和SARS冠狀病毒S蛋白擁有相同功能的宿主細(xì)胞受體，即血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2，angiotensin converting enzyme2），這就促使了研究人員通過(guò)表面等離子體共振技術(shù)（SPR，surface plasmon resonance）來(lái)研究介導(dǎo)這種相互作用的動(dòng)力學(xué)特性，讓研究人員驚訝的是，ACE2與新型冠狀病毒S蛋白胞外域結(jié)構(gòu)之間結(jié)合的親和力為15 nM（平衡解離常數(shù)），其是ACE2與SARS冠狀病毒S蛋白胞外域結(jié)構(gòu)之間結(jié)合親和力的10-20倍。 此外，研究人員還制造了ACE2與新型冠狀病毒S蛋白胞外域結(jié)合的復(fù)合體，并利用負(fù)染色電鏡技術(shù)對(duì)其進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該復(fù)合體與SARS冠狀病毒S蛋白-ACE2復(fù)合體的結(jié)構(gòu)（利用高分辨率的冷凍電鏡技術(shù)觀察）非常相似；新型冠狀病毒對(duì)人類(lèi)ACE2的高親和力或許有助于解釋為何該病毒易于在人與人之間進(jìn)行傳播擴(kuò)散，但后期還需要研究人員進(jìn)一步深入研究來(lái)闡明。

新型冠狀病毒S蛋白和SARS冠狀病毒S蛋白之間總體的結(jié)構(gòu)同源性和共享受體使用或能幫助我們檢測(cè)已經(jīng)公布的SARS冠狀病毒受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域定向單克隆抗體與新型冠狀病毒受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的交叉反應(yīng)特性；目前研究者已經(jīng)對(duì)新型冠狀病毒受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的SD1片段（S蛋白殘基319-591）進(jìn)行了重組表達(dá)，并利用生物層干涉技術(shù)（BLI）測(cè)定ACE2的結(jié)合水平來(lái)證實(shí)這種重組體的折疊狀況，隨后研究者利用BLI來(lái)評(píng)估SARS冠狀病毒受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域定向單克隆抗體S230、m396和80R的交叉反應(yīng)特性。盡管新型冠狀病毒和SARS冠狀病毒的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)構(gòu)同源性程度較高，但在1uM的測(cè)定濃度下，研究者并未發(fā)現(xiàn)上述三種抗體與新型冠狀病毒受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，盡管三種抗體的抗原表位僅代表了新型冠狀病毒受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域較小比例的表面面積，目前缺乏研究證據(jù)表明，SARS定向的單克隆抗體不一定具有交叉反應(yīng)性，而后期研究人員或許也能利用新型冠狀病毒的S蛋白作為探針來(lái)進(jìn)行抗體的分離和治療研究等工作。

新型冠狀病毒在全球的傳播擴(kuò)散促使WHO將其認(rèn)定為國(guó)際公共衛(wèi)生緊急事件，目前研究人員迫切需要開(kāi)發(fā)出針對(duì)該病毒的新型疫苗和治療手段，而在原子水平下闡明新型冠狀病毒S蛋白的精細(xì)化結(jié)構(gòu)或有望幫助后期開(kāi)發(fā)出新型抗病毒療法和疫苗。（生物谷Bioon.com）

參考資料：

Daniel Wrapp， Nianshuang Wang， Kizzmekia S. Corbett， et al. Cryo-EM Structure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation， bioRxiv (2020) doi：10.1101/2020.02.11.944462

Daniel Wrapp et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science, 2020, doi:10.1126/science.abb2507.